Ксеногенная трансплантация островковых клеток без иммуносупрессивной терапии в лечении инсулинзависимого сахарного диабета
А. В. Прохоров
С. И. Третьяк
В. В. Руденок
Авторами обобщены результаты экспериментальной и клинической ксенотрансплантации в лечении инсулинзависимого сахарного диабета без иммуносупрессивной терапии. Морфологическими исследованиями показана возможность длительного сохранения макроинкапсулированной ксеногенной культуры островковых клеток в сосудистом русле реципиента без иммуносупрессивной терапии. По разработанной методике оперированы 13 больных с сахарным диабетом. Клинико-лабораторные исследования продемонстрировали увеличение уровня тощакового и постпрандиального С-пептида, иммунореактивного инсулина, снижение показателя фруктозамина и потребности в инсулине до 70—85%. Авторы делают заключение о достаточно высокой эффективности внутрисосудистой ксенотрансплантации как выгодной альтернативе аллотрансплантации.
В настоящее время создание биоискусственного источника инсулинпродуцирующей ткани представляется наиболее перспективным направлением в хирургическом лечении инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД). В мире уже накоплен довольно большой опыт алло- и ксеногенных трансплантаций островковых клеток поджелудочной железы 3, 5, 7. Однако, несмотря на использование различных методологических подходов к трансплантации, результаты лечения остаются не вполне удовлетворительными. Не удается добиться стойкого и длительного гипогликемического эффекта пересадки главным образом из-за реакции отторжения и гибели трансплантата. Основным методом предупреждения острого и хронического отторжения остается иммуносупрессивная терапия, дающая выраженный нефро-и гепатотоксический эффект и оказывающая крайне неблагоприятное влияние на течение сахарного диабета и иммунный статус реципиентов 5, 7, 11.
Одним из направлений в преодолении иммунного барьера реципиентов является иммуноизоляция пересаживаемых клеток. Многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями была показана возможность иммуноизоляции островковых клеток путем их микроинкапсуляции в гелевые, агарозные или альгинат-полилизиновые мембраны. Однако развитие фиброзной ткани быстро приводило к нарушению питания, апоптозу и гибели культуры клеток 6, 8.
Использование иммунопривилегированных зон “местообитания” трансплантата представляется нам более привлекательным направлением в клеточной трансплантации 4. Это позволяет отказаться от иммуносупрессивной терапии и использовать не только аллогенные, но и ксеногенные источники инсулинпродуцирующей ткани. Последнее весьма актуально из-за дефицита фетального и взрослого донорского аллогенного материала, а также многих этических проблем 3, 5, 7, 10. Достаточно сказать, что, по данным зарубежных исследователей, для одной интрапортальной аллогенной трансплантации требуется от 2 до 4 взрослых донорских поджелудочных желез 11, 12.
Проведенные нами экспериментальные исследования на собаках показали, что внутрисосудистая пересадка макроинкапсулированных ксеногенных островковых клеток позволяет успешно компенсировать аллоксаниндуцированный диабет и сохранить жизнеспособность 70-75% пересаженных клеток 2. Для иммуноизоляции островковых клеток нами была применена макроинкапсуляция в микропористые капсулы из производных полиамида с диаметром пор 1-2 мкм 13. Пересадку капсулы с культурой b-клеток производили в абдоминальный отдел аорты ниже отхождения почечных сосудов путем продольной аортотомии и фиксации капсулы к интиме сосуда двумя П-образными швами. Клинические наблюдения и контроль гликемии после экспериментальной ксенотрансплантации свидетельствовали о быстром купировании клинических признаков диабета и нормализации уровня глюкозы крови у всех животных на 3-4-е сутки после пересадки. Морфологические исследования препаратов “аорта-капсула” были выполнены через 1, 3, 6, 13 и 18 мес после трансплантации. На серийных поперечных срезах спустя 1-3 мес после трансплантации в просвете аорты отчетливо прослеживалась капсула, фиксированная к стенке сосуда. Просвет аорты оставался свободным, без признаков тромбоза. В просвете капсулы хорошо прослеживались клетки, имеющие округлое, крупное, центрально расположенное ядро, окруженное ободком цитоплазмы (рис. 1). Внутри ядер визуализировались ядрышки и глыбки хроматина. Клетки располагались компактно, большими группами, включающими 20-30 клеток и более. Волокнистый компонент, представленный рыхлой соединительной тканью, разделял эти клеточные группы. На границе со стенкой аорты и внутри капсулы прослеживались формирующиеся и сформированные кровеносные сосуды с форменными элементами в просвете.
Рисунок 1. Макрокапсулированные -клетки поджелудочной железы плодов кролика в просвете аорты собаки через 2 мес после ксенотрансплантации.Примечание. Стрелками обозначены кровеносные оссуды. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Морфологическая картина через 6 и 18 мес после трансплантации сохраняла все признаки, характерные для предыдущих сроков наблюдений, при отсутствии признаков тромбоза и лимфоцитарно-моноцитарной инфильтрации. Группы пересаженных клеток, заключенные в каркас зрелой соединительной ткани, формировали структуру, подобную островкам Лангерганса поджелудочной железы (рис. 2).
Рисунок 2. Макрокапсула с -клетками поджелудочной железы плодов кролика в просвете брюшной аорты собаки через 18 мес после ксенотрансплантации.Примечание. Стрелками обозначена стенка капсулы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 1000.
Основываясь на результатах экспериментальных исследований и на многолетнем опыте ксеногенных трансплантаций НИИТ и ИО (Москва) 3, 5, мы на протяжении 2001-2003 гг. выполнили клиническую ксенотрансплантацию культуры островковых клеток поджелудочной железы плодов кроликов в сосудистое русло 13 больным с ИЗСД, срок наблюдения за 8 больными более 2 лет. Мужчин было 7, женщин - 6, возраст больных от 24 до 52 лет. У 3 пациентов причиной диабета был ранее перенесенный панкреонекроз. Потребность в инсулине у всех больных до операции составляла от 46 до 62 ЕДсут. Показаниями к трансплантации явились: лабильное течение диабета с частыми гипо- и гипергликемическими состояниями, кетоз, нарастающая резистентность к экзогенному инсулину, прогрессирующие вторичные осложнения диабета (ретинопатия, ангиопатия, нефропатия).
Культуру островковых клеток получали по методике F. Misler и соавт. 9 в нашей модификации с последующим микробиологическим, вирусологическим и туморопластическим тестированием. Функциональную активность культуры оценивали с помощью набора для определения иммунореактивного инсулина (ИРИ), световой микроскопии с использованием инвертированного микроскопа и окраски культуры дитизоном. В среднем количество островковых клеток для каждой трансплантации составляло от 7 до 10 млн (рекомендуемое количество >6000 IЕs на 1 кг 7, 11, 12).
Первой пациентке ксенотрансплантация была выполнена по разработанной в эксперименте методике в абдоминальный отдел аорты. Несмотря на то что послеоперационный период протекал без осложнений, травматичность вмешательства, а также потенциальная возможность общехирургических осложнений (кровотечение, отрыв капсулы, тромбоз с нарушением кровоснабжения нижних конечностей, органов малого таза, органов системы нижнебрыжеечной артерии) заставили нас изменить методику. Последующим реципиентам трансплантация была выполнена в глубокую артерию бедра (ГАБ) с использованием аутовенозной ангиопластики 1.
До- и послеоперационный контроль эффективности трансплантации осуществляли на основании клинических данных, а также лабораторного определения суточного профиля гликемии и потребности в инсулине, уровня С-пептида в сыворотке (C-Peptid Irma, “Immunotech”, Чехия), сывороточного фруктозамина - ФА (Fructosamin kit, “Rosh-diagnostik”, Польша), ИРИ (Riо-ИНС-ПГ-1251, ИБОХ, Беларусь).
Первые сутки послеоперационного периода у всех пациентов характеризовались нормализацией уровня глюкозы крови и снижением потребности в инсулине до 6-16 ЕДсут. Такое резкое снижение потребности в инсулине мы связывали с вымыванием из капсулы “базального” инсулина. В последующие сутки отмечались значительные колебания гликемии с потребностью в инсулине до 40-45 ЕДсут. Наибольшие колебания гликемии наблюдались у реципиентов с аутоиммунным ИЗСД. Такое нестабильное течение диабета скорее всего было связано с адаптацией культуры клеток к новым условиям функционирования. Через 1-1,5 мес после пересадки отмечались постепенная стабилизация течения диабета и снижение суточного уровня глюкозы до 4,5-9,8 ммольл, а потребности в инсулине до 25-32 ЕДсут. В последующем эти показатели оставались стабильными и общее снижение потребности в инсулине достигало 60-65% (рис. 3).
Рисунок 3. Измерение уровня суточной потребности в экзогенном инсулине (в ЕД) и суммарный уровень глюкозы (в мМ) у реципиентов (n=8) после трансплантации.
Наиболее благоприятный эффект был отмечен у 3 больных с ИЗСД после перенесенного панкреонекроза. Колебания уровня глюкозы в раннем послеоперационном периоде были незначительными и легко корригировались инъекциями простого инсулина. У этих пациентов потребность в инсулине через 2 нед после трансплантации уменьшилась на 80-85% и составила 16-18 ЕДсут с сохранением стойкой нормогликемии.
Одновременно со стабилизацией течения диабета значительно улучшилось состояние больных. Исчезли слабость, жажда, чувство страха перед возможным развитием гипогликемической комы. Через 6-8 мес больные отмечали увеличение массы тела на 3-5 кг.
Исследования уровня С-пептида до операции свидетельствовали о полной функциональной несостоятельности собственных -клеток. У всех пациентов этот показатель до трансплантации не определялся. Исследования уровня С-пептида на 7-е сутки, через 3, 6, 12, 18 мес демонстрировали его повышение с нуля до 28,0±4,0 нМ (p<0,05) натощак, а постпрандиальный уровень составлял 36,0±8,1 нМ (p<0,05). Повышение уровня С-пептида прямо коррелировало со снижением потребности в инсулине, суточной гликемии и достоверным повышением уровня ИРИ до значений, составляющих 41±11,2 мкед. С течением времени наступало и достоверное снижение показателя сывороточного ФА на 30 - 60 мкМ как маркера гликирования белков (рис. 4).
Рисунок 4. Измерение уровня ИРИ (в мкед) и С-пептида (в нМ) у реципиентов (n=8) после трансплантации.Примечание. Стрелками обозначены периоды, когда происходило нарастание показателей.
Всем пациентам через 2 нед, 1, 6, 12 и 18 мес были выполнены контрольные сонография и допплерография сосудов в зоне трансплантации с целью подтверждения отсутствия тромбоза и сохранения кровотока. Ни в одном наблюдении тромбоза не отмечено. Скорость кровотока по общей бедренной артерии составляла ~1,35 мс, по глубокой артерии бедра в зоне имплантации капсулы ~ 1,5 мс.
В послеоперационном периоде осложнения были отмечены у 2 пациентов. У одного больного, оперированного на фоне хронической почечной недостаточности в уремической стадии нефропатии, в течение 30 дней отмечалась лимфорея в зоне вмешательства в верхней трети бедра. В другом наблюдении возникло инфицирование раны с несостоятельностью аутовенозной ангиопластики и развитием ложной аневризмы ГАБ, что потребовало удаления капсулы с культурой клеток и перевязки ГАБ. При этом потребность в инсулине, снизившаяся с 52 до 24 ЕДсут после трансплантации, возвратилась к исходному показателю после удаления имплантата.
Две пациентки с аутоиммунным ИЗСД через 11 и 12 мес после трансплантации вернулись к прежним дозам экзогенного инсулина, хотя уровни тощакового и постпрандиального С-пептида остаются у них довольно высокими до настоящего времени. Это косвенно подтверждает функционирование трансплантата.
Наиболее благоприятный результат ксенотрансплантации был отмечен у реципиентов с панкреатогенным ИЗСД и у больных с нормальной массой тела. Максимальное снижение у них потребности в инсулине составило 70-85% при стабильном уровне гликемии в течение всего периода наблюдения. Долговременный эффект трансплантации у этих реципиентов скорее всего связан с неиммунной природой диабета и низкой цитотоксичностью плазмы. Как показали наши исследования, низкая цитотоксичность плазмы в отношении пересаживаемой культуры клеток является одним из важнейших критериев отбора реципиентов для трансплантации. К сожалению, неясной остается причина отсутствия полного нормогликемического эффекта трансплантации при достаточно позитивных лабораторно-функциональных тестах. При этом количество пересаженных островков существенно не влияло на послеоперационный результат. Особо следует отметить, что у 2 пациенток, которые через 11 и 12 мес вернулись к прежним суточным дозам инсулина, островковые клетки продолжали функционировать, что подтверждалось довольно высокими уровнями С-пептида и ИРИ. Одной из вероятных причин неполного гипогликемического эффекта пересадки может быть гибель определенного пула островковых клеток в раннем посттрансплантационном периоде из-за нарушения трофики клеток. Ряд экспериментальных исследований свидетельствует, что отсутствие реваскуляризации трансплантата в первые несколько недель после пересадки ведет к апоптозу и гибели островковых клеток 6.
Анализируя результаты экспериментальных и клинических исследований, можно сделать заключение, что ксенотрансплантация островковых клеток поджелудочной железы является выгодной альтернативой аллотрансплантации, так как обладает высокой функциональной способностью и позволяет преодолеть дефицит аллогенного клеточного материала. Макрокапсуляция островковых клеток с имплантацией их в сосудистое русло как иммунологически привилегированную зону дает возможность преодолеть острое и хроническое отторжение трансплантата без иммуносупрессивной терапии, значительно снизить инсулинзависимость реципиентов, уменьшить потребность в инсулине, компенсировать гипо- и гипергликемические состояния, стабилизировать течение диабета, улучшить качество жизни больных. В то же время ряд вопросов требует дальнейшего изучения. Это касается разработки более совершенных методов иммуноизоляции, создания адекватной васкуляризации и трофики трансплантата. Неоднозначный результат пересадки у больных с ИЗСД при соблюдении стандартного протокола трансплантации требует дальнейшего изучения критериев предоперационного отбора реципиентов. В первую очередь это касается больных молодого возраста с аутоиммунной природой ИЗСД. Одним из важнейших критериев мы считаем предтрансплантационное исследование цитотоксичности плазмы реципиента в отношении пересаживаемой культуры клеток.
Прохоров А.В., Третьяк С.И., Горанов В.А., Романович В.П. Интрасосудистая ксенотрансплантация островковых клеток в лечении инсулинзависимого сахарного диабета. Достижения медицинской науки Беларуси. Выпуск VII. Минск: ГУ РНМБ 2002; 96-97.
Прохоров А.В., Третьяк С.И., Горанов В.А., Маркелов Д.В. Свободная трансплантация культуры b-клеток в лечении экспериментального сахарного диабета. Актуальные вопросы современной медицины. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 80-летию БГМУ, ч. 2. Минск 2001; 91-93.
Скалецкий Н.Н., Гончарова Т.Н., Засорина Л.В. и др. Ксенотрансплантация культур островковых клеток на пути достижения длительной инсулиннезависимости у больных сахарным диабетом I типа. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2002; 3: 85-86.
Шотт А.В., Третьяк С.И., Леонтюк А.С. Необычные иммунологические реакции в трансплантологии. 23-й пленум Правления общества белорусских хирургов: Тез. докл. 22-23 апреля 1999 г. МЗ РБ в двух частях. Гродно 1999; 190-191.
Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скaлецкий Н.Н. и др. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М: Канон 1995; 383.
De Vos P., Hamel A.F., Tatarkiewicz K. Considerations for successful transplantation of encapsulated pancreatic islets. Diabetologia 2002; 45: 2: 159-173.
Kovarik J., Mandel T.E. Islet Transplantation. Transplant Proc 1999; 31: 45-48.
Lanza R.P., Borland K.M., Staruk J.E. et al. Transplantation of encapsulated islets into spontaneously diabetic BB/Wor rats without immunosupression. Endocrinology 1992; 131: 637-642.
Misler F., Mordes J.P., Rossini A.A. Animal models of diabetes. Am J Med 1981; 70 (2): 353-360.
Platt J.L., Lin S.S. The Future Promises of Xenotransplantation. Ann N Y Acad Sci 1998; 862: 5-18.
Ryan E.A., Lakey J.R.T., Paty B.W. et al. Successful Islet Transplantation. Diabetes 2002; 51: 2148-2157.
Shapiro A.M., Lakey J.R., Rajotte R.V. et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med 2000; 343: 230-238.
Tretsyak S.I., Proсhorov A.V., Goranov V.A., Mokhort T.V. The use of polyamide for macroencapsules for b-cells transplantation. 22th EASD-congress. Hungary. Budapest. 17-23 September 2002; 420.
Вернуться к содержанию номера
